O código abaixo criará, a partir de um shapefile, um arquivo de camada chamado test_A.lyr que possui uma Consulta de definição de "testField" = 'A' salva nele.
import arcpy
arcpy.MakeFeatureLayer_management(r"C:\temp\testLines.shp","test_lyr")
lyr = arcpy.mapping.Layer("test_lyr")
lyr.name = "test"
lyr.definitionQuery = '"testField" = ' + "'A'"
lyr.saveACopy(r"C:\temp\test_A.lyr")
del lyr
Se necessário, você também pode adicionar esse arquivo de camada, ou o objeto Layer (lyr), antes de ser salvo como um arquivo de camada, no seu mapa via arcpy.mapping.AddLayer.
Para ver se uma cláusula where em MakeFeatureLayer é passada como uma Consulta de Definição, que eu acho que é um comportamento não documentado, realizei um segundo teste abaixo para verificar a Resposta de @John, e ele está correto.
arcpy.MakeFeatureLayer_management(r"C:\temp\testLines.shp","test_lyr2",'"testField" = ' + "'A'")
lyr2 = arcpy.mapping.Layer("test_lyr2")
lyr2.name = "test2"
lyr2.saveACopy(r"C:\temp\test_2.lyr")
del lyr2
arcpy.mapping.layer()
foi substituído porarcpy.mp.LayerFile()