Não se preocupe com o desempenho - dois discos são melhores apenas quando você trabalha com os dois ao mesmo tempo, como ao copiar de um para o outro.
Ou, se você tiver duas VMs ativas e trabalhando ao mesmo tempo, ter cada uma em seu próprio disco melhoraria a taxa de transferência do disco, com a condição de ter uma CPU com vários núcleos (ou vários threads). Mas se as duas VMs ativas estiverem no mesmo disco rígido, não haverá importância em qual disco elas estão.
Dito isto, aqui estão algumas matemáticas: 2 x 320 = 640> 500. Então você ganha 140 GB.
Se você optar pela solução de 2 discos, 320 GB é muito grande para um disco do sistema. Eu iria ainda mais longe e particionaria o primeiro disco em, digamos, disco de sistema de 40 GB com o Windows e todos os aplicativos. Isso facilita o backup de uma imagem do disco do sistema, o que eu faço sistematicamente antes de deixar o Windows Update da Microsoft destruir o meu sistema em execução.
Nesse caso, eu teria:
C = partição do disco 1 1 (40 GB)
D = disco2 (320 GB)
E = partição do disco 1 2 (280 GB)
Observe que o reparticionamento da unidade C provavelmente envolverá a reinstalação do Windows (ou a restauração da partição de restauração OEM após o particionamento).